磷酸化多肽價(jià)格及磷酸化多肽操作步驟

操作步驟：

　　1.剪一適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜并劃成25px大小的方格;

　　2.用(磷酸化多肽價(jià)格)緩沖液A浸濕膜并放于一用同樣緩沖液浸濕的濾紙上，使膜平坦;

　　3.用緩沖液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)將樣品稀釋到合適的濃度，膜上每個(gè)點(diǎn)所加的樣品其激酶活性在0.5～50pmol單位(1pmol單位代表每分鐘轉(zhuǎn)移1pmol 32P的酶量)，當(dāng)酶比活性在1μmol/min·mg-1時(shí)則每個(gè)點(diǎn)應(yīng)加純酶0.5～50ng;

　　4.用微量加樣器加1～5μl樣品于膜上方格中央，待液滴消失后將膜面對含有緩沖液A(包括1～10mg/ml的底物)的Parafilm封口膜(貼于玻璃平板上)，在濕潤環(huán)境中23℃作用30分鐘。大片膜可密封于塑料袋中;

　　5.在100ml緩沖液A中洗膜并置于一新的Parafilm膜上(加有反應(yīng)混合物溶液25μl/cm2)，23℃作用5～30分鐘;

　　6.用(磷酸化多肽價(jià)格)緩沖液A 100ml洗膜4次，空氣干燥后進(jìn)行放射自顯影。或切成方塊進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)定量。

　　該方法在應(yīng)用時(shí)*常見的問題是硝酸纖維素膜過載(指總蛋白或酶活力單位)。硝酸纖維素膜結(jié)合BSA的線性范圍可達(dá)50μg/cm2(相當(dāng)于每斑點(diǎn)5μg)，而結(jié)合容量可達(dá)500μg/cm2，如果樣品本身造成蛋白質(zhì)超載，則應(yīng)降低稀釋液中的BSA濃度。同時(shí)應(yīng)注意不要加過量的酶，因?yàn)槌^50pM單位即超過了該方法的線性范圍，并可能影響硝酸纖維素膜鄰近斑點(diǎn)的檢測。該方法用于其它蛋白激酶檢測時(shí)應(yīng)適當(dāng)變換測定條件。因蛋白激酶活性的斑點(diǎn)印跡方法與標(biāo)準(zhǔn)的液相方法在靈敏度、檢測范圍、線性等方面相當(dāng)，所以可以代替后者進(jìn)行常規(guī)檢測。也在天然凝膠電泳和轉(zhuǎn)移電泳后分析蛋白激酶活性的分布，可用于分析酶在不同發(fā)育階段各組織表達(dá)的變化、cDNA克隆分析和突變體分析。

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